ペーパークロマトグラフィーの実験



　　１．　蛍光ペン等の実験：


　　ペーパークロマト法は、展開に時間がかかるので 薄層クロマト（ＴＬＣ）ほど用いられないが、支持体不要で、ろ紙を切って用いるという簡便さがある。 また、展開後のろ紙の部分を切り取って 他の実験に用いることができる。

　　各種の 蛍光ペン、水性ペン、油性ペン、比較のために前節（１．（２））で作成したフルオレセインの重曹溶液を用いて（楊枝の頭で付ける）、水 および エタノールで展開した。 ろ紙は、比較的緻密な定性ろ紙（ADVANTEC、５Ｃ、φ１２５ｍｍ）を 約７〜８ｃｍ角に切って使用した。上からクリップで吊るし、ラップをかけて行なう。
　　蛍光の確認には、水銀灯を用いた。（ブラックライト、紫外線ＬＥＤでもできる。）

　　結果は、 蛍光ペンに含まれる色素は フルオレセインそのものではなく、（おそらく その誘導体の）別の蛍光色素だった。　水性ペンが 昔は３色（赤、青、黄）に分かれていたが、今回のペンでは黒の単色だった。　青色、緑色のマーカーでは 蛍光は弱い。　フルオレセイン・ナトリウム塩はエタノールに不溶。　マジックペンでは溶け残りが尾を引く。

　　



　　２．　葉の色素の実験：


　　植物の葉などの色素を抽出して 展開し、クロロフィル ａ（青緑）、ｂ（緑）、キサントフィル（黄色）、βカロテン（黄橙）、（アントシアン（赤））などの挙動を見る。
　　展開液は、　石油エーテル：アセトン ＝ １０ ： １　のところを、（石油エーテルが無かったので） ｎヘキサン：アセトン ＝ １０ ： １　として行なった。
　　試料は、 緑茶紛、紅茶紛、輪切りの赤トウガラシ をエタノールで抽出したもの、および つつじの葉を細粒のシリカゲルを加え 乳鉢で破砕し、ジエチル・エーテルを少し加えたもの を用いた。　塗布は、楊枝の頭を斜めに用い、数回繰り返してスポットした。

　　石油エーテル：アセトン＝１０：１　のときの Ｒｆ 値（出発点からの位置/溶媒端までの長さ）は、

　　結果は、色が薄く、やっと確認できるレベルだったが、それなりの規則的な順番が現れた。 試料はかなり濃縮した方が良いと思われる。　緑茶の緑色は クロロフィルｂだった。 紅茶は葉の色素が壊れている。　トウガラシ、緑茶について、エタノールで展開した場合は全部移動した。
　　かなり濃く出したつつじ葉では、ヘキサン‐アセトンで、明瞭な４つの色素に分かれた。　このクロロフィルａ のうちのごく一部が 光合成に関わっているといわれる。

　




　　３．　アミノ酸の呈色実験：　　フェノール劇物注意


　　各試料のアミノ酸を ２種類の展開液で展開し、ニンヒドリン（Ｃ9Ｈ6Ｏ4）で呈色させ、それぞれの Ｒｆ 値と 色から アミノ酸の種類を推定する。
　　展開液Ａ：　フェノール ： 水 ＝ ８０ｇ ： ２０ｇ、　展開液Ｂ：　１‐ブタノール ： 酢酸 ： 水 ＝ ４０ｍｌ ： １０ｍｌ ： １０ｍｌ
　　呈色液：　ニンヒドリン ０．２ｇ / エタノール１００ｍｌ　（スプレー容器）　・・・　呈色反応は鋭敏で 指紋でも色がつくので、ろ紙を持つ所に注意

　　各Ｒｆ 値は、
　　　・　Ａ液：　フェノール：水＝８０ｇ：２０ｇ の場合、　　　　　

　　　・　Ｂ液：　１‐ブタノール：酢酸：水＝４０ｍｌ：１０ｍｌ：１０ｍｌ　の場合、

　　ニンヒドリンとの反応：　　１）　α‐アミノ酸 に対し、　紫色 （ルーヘマン紫、吸収λ ５７０ｎｍ）、　　　２）　第二級アミン（旧イミノ酸） に対し、　黄色 (吸収 λ ４４０ｎｍ）

　　　

　　（１）　遊離アミノ酸 と 調味料：

　　アミノ酸試料として、グリシン（試薬）、酸析して作成したＬ‐グルタミン酸、　および、　味の素（グルタミン酸Ｎａ ９７．５％、イノシン酸Ｎａ １．２５％、グアニル酸Ｎａ １．２５％）、 和風だし、 コンソメスープの素 を用いた。　Ｌ‐グルタミン酸（溶解度：０．８４ｇ/１００ｇ水、ｐＨ２・９〜３・９）の酸析は、味の素（グルタミン酸ナトリウムの溶解度：６０ｇ/１００ｍｌ）１７ｇ/２００ｍｌ水 ＋ 塩酸（３５％、８ｍｌ）/１００ｍｌ水　で行ない、ろ過・乾燥して作成した。（イノシン酸、グアニル酸は除かれている）

　　展開後、液の境界線に鉛筆で線を描いて、アイロン等で乾かし、ニンヒドリンをスプレーして あぶり出しのように熱すると 濃い色が出てくる。

　　結果は、　グルタミン酸（紫色）がすべての調味料に含まれて、うま味調味料として配合されている。　（イノシン酸（かつお味）、グアニル酸（きのこ味）は、呈味ヌクレオチドなので ニンヒドリンでは呈色しない）

　

　　（２）　たんぱく質の加水分解によるアミノ酸の２次元ペーパークロマト：

　　２次元なので、ろ紙の大きさは ８〜９ｃｍ角程度になるようにする。
　　試料は、 卵白（ゆで卵の白身を潰したもの）と 粉ゼラチン（＝コラーゲン（豚皮）） の、それぞれ０．５〜１ｇを取り、約５Ｎ 塩酸 １０ｍｌ、８０℃前後で ２４時間 加水分解したもの。 それぞれの一方には、重曹で中和し、もう一方はそのまま用いる。
　　塩酸、硫酸などの酸で加水分解すると、Ｌ形アミノ酸は保たれる。トリプトファンは分解してフミンとなり褐色沈殿ができる。 一方、強アルカリ（苛性ソーダ、バリタ（Ｂａ（ＯＨ）2））で加水分解すると、ラセミ体となり、トリプトファンは保たれる。　硬いものならば４８時間加熱が必要。
　　展開は、Ａ液で最初行ない（１時間くらいかかる）、アイロン等で乾かし、次に直交して Ｂ液で展開する（２０分くらい）。ろ紙の面を指等で触れないよう注意。

　　アミノ酸のデータは次の通り（１００ｇ中）：
　　　　・　卵白：　　グルタミン酸 １２ｇ/１００ｇ、　アスパラギン酸 ９．３ｇ、　ロイシン ７．３ｇ、　リシン ６．１ｇ、　セリン ６．０ｇ、　バリン ５．８ｇ、　アラニン ５．３ｇ、　フェニルアラニン ５．１ｇ、・・・、プロリン ３．３ｇ、　グリシン ３．２ｇ、・・・　トリプトファン １．３ｇ　等になっていて、１８種がバランスよく均等に含まれている。
　　トリプトファンが加水分解によってフミンになり、褐色の沈殿ができるので、活性炭粉を混ぜてろ過して除く。

　　　　・　ゼラチン：　グリシン ３３ｇ/１００ｇ、　イミノ酸（プロリン １３ｇ、 オキシプロリン ９．１ｇ）、　アラニン １１ｇ、　グルタミン酸 ７．２ｇ、　アルギニン ４．９ｇ、 アスパラギン酸 ４．５ｇ、　ロイシン ２．４ｇ、等で、 グリシンで 全体の１/３、 イミノ酸で ２/９ を占めている。 トリプトファンは０であり、加水分解後も少し色がつく程度で、そのまま用いる。


　　結果は、概略は読めるが、Ａ液（フェノール・水）で展開する部分はかなり引っ張られて重なり、相互分離がうまくいかなかった。
　　また、ペプシンなどの酵素でタンパク質を分解する方法もあるので、次回はこれを試したい。

　　





　　溶媒に水が飽和するとき Ｒｆ 値が高くなり、また アンモニア、酢酸などの添加により アミノ酸相互の分離が良くなる。　一般的には、フェノール＋アンモニアで行なうので、展開液Ａ に、２８％アンモニア水 ６ｍｌ加えて、同様に 卵白とゼラチン（中和無し、５，６回スポットして濃くした）を展開してみた。
　　すると、縦方向（展開液Ａの方向）で、新たな斑点が現れたので、ある程度分離が良くなったと思われる。 ただし、それがどのアミノ酸であるかは、個別に既知のアミノ酸で確認する必要がある。 （右側の広い黄色は焼けノイズ）

　　　

　　　　　§　色素の歴史：

　　使徒の働き１６章１４節には、使徒パウロがマケドニアに始めて伝道に行ったとき、テアテラ出身の紫布の商人の ルデヤという婦人がパウロたちを受け入れ、多くの支援をしたことが書かれています。 当時、紫布は、王侯貴族やローマ兵の上級の者たちが着る 服やマントに用いられ、非常に高価かつ特権階級しか着用を許されず、一時期は、染めた繊維の重さが同じ金の重量で取引されるほどでした。これは、フェニキアのアカニシガイのパープル腺から取った「貝紫」で染めた赤紫色のもので、現在でも 合成されていません。

　　鮮やかな青藍色に染める 「インジゴ」は、紀元前７世紀のバビロニア時代から知られ、１５世紀後期頃から インド、タイ、中南米で採れる 天然インジゴが用いら始めました。 イギリスの産業革命に伴い、１７世紀から１８世紀にかけて、羊毛や綿織物の工業生産性が飛躍的に上がり、その余剰の商品を売るため、海外植民地に市場を求めました。 インジゴ染色の繊維はインド製よりも付加価値が高く、インドなどに売りつけ植民地として支配してきました。（大恐慌の１９２９年の頃には、イギリスは４０−５０％輸出で、今の中国の１５％よりもはるかに多かった。 その国の工業生産性が、帝国主義の原動力となり、当時の中国やインドは 貧困化していった。）
　　さらに、１９００年頃 合成インジゴが取って代わり、さらに生産性を上げていきました。 現在でも、アメリカのジーンズの紺色や、青色２号（食品・化粧品など）、日本の藍染等に用いられています。


　　　・・・・・・・
　　　　「しかし、あなたがたに言いますが、栄華をきわめた時のソロモンでさえ、これらの花の一つほどにも着飾ってはいませんでした。
　　　今日は生えていて、あすは炉に投げ入れられる野の草でさえ、神はこのように装って下さるのなら、あなたがたに、それ以上良くしてくださらないはずがあるでしょうか。ああ、信仰の無きに等しい者たちよ。
　　　だから、何を食べようか、何を飲もうか、あるいは何を着ようかと言って思い煩うのをやめなさい。
　　　これらのものはみな、国々の民が切に求めているものです。　あなたがたの天の父は、これらのものが、ことごとくあなたがたに必要であることをご存じです。
　　　しかし、あなたは まず第一に、 神の御国と神の義とを 探し求め続けなさい。　そうすれば、これらのすべてのものは 与えられ続けます。」 （マタイの福音書６章２９−３３節）

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